Автор: Алена Гурьева
Холодный взгляд биофизики: криоэлектронная микроскопия в поисках белковой структуры
В этом году Нобелевскую премию по химии дали «за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул с высоким разрешением в растворе». Криоэлектронная микроскопия получила активное развитие еще в 80–90-е годы прошлого века. Так в чем же заключается прорыв и как эта методика способна помочь в изучении болезней Альцгеймера и Паркинсона разбираемся вместе с руководителем лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессором физической биохимии Технического университета Дармштадта Норбертом Денчером.
Криоэлектронный микроскоп — это мощный инструмент для исследования биологических структур, в том числе белков. Он «фотографирует» замороженный белковый раствор пучком электронов, а совмещение фотографий с разных плоскостей позволяет увидеть пространственную структуру белка.
О перспективах этого прибора и соответствующего метода один из теперешних обладателей премии Ричард Хендерсон заявил на научной конференции еще в 1997 году. Многие коллеги тогда отнеслись к этому скептически, однако спустя 20 лет с уверенностью можно сказать, что Хендерсон оказался прав. Что же успело измениться?
О перспективах этого прибора и соответствующего метода один из теперешних обладателей премии Ричард Хендерсон заявил на научной конференции еще в 1997 году. Многие коллеги тогда отнеслись к этому скептически, однако спустя 20 лет с уверенностью можно сказать, что Хендерсон оказался прав. Что же успело измениться?
Все новое — хорошо забытое старое
«Классическая» электронная микроскопия действительно существует уже очень давно. Мы с коллегами начали использовать ее более 10 лет назад, чтобы определить структуру белков, участвующих в преобразовании энергии в клетке. Тогда мы смогли добиться разрешения в 30 ангстрем (10 ангстрем соответствуют 1 нанометру — прим. ред.), — это данные очень низкого разрешения, далекие от атомарного масштаба. Чтобы разрабатывать лекарства, нам необходимо знать строение белка на уровне не менее 2,4 ангстрем, а лучше 1 ангстрем.
Норберт Денчер
руководитель лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессор физической биохимии Технического университета Дармштадта
Cancer drug target visualized at atomic resolution
The protein p97 is trapped in an inactive state by a new inhibitor (red) and the molecule cannot proceed into its normal reaction cycle. Image created using cryo-electron microscopy.
Credit: National Cancer Institute, National Institutes of Health
The protein p97 is trapped in an inactive state by a new inhibitor (red) and the molecule cannot proceed into its normal reaction cycle. Image created using cryo-electron microscopy.
Credit: National Cancer Institute, National Institutes of Health
Повышение эффективности детекторов электронов и появление новых технологий позволили увеличить разрешение. Нобелевскую премию разделили между собой трое ученых: Ричард Хендерсон первым в мире получил структуру белка, Жак Дюбоше изобрел метод получения мономолекулярной пленки, которая необходима для фотографирования молекул, а Йоахим Франк разработал принцип обработки полученных снимков и создания итогового трехмерного объекта. Криоэлектронная микроскопия стала мощнейшим инструментом для исследования биологических структур, в том числе белков. Знание об их устройстве может стать ключом к лечению ряда заболеваний, например, нейродегенеративных — медленно прогрессирующих болезней нервной системы. Исследованиями в этом направлении Норберт Денчер занимается в Германии, а теперь еще и на Физтехе.
Лаборатория старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний изучает молекулярные механизмы болезней, которые вызывают расстройство памяти и мышления: Альцгеймера и Паркинсона. В 95 процентах случаев мы не знаем точных причин их возникновения, но они определенно связаны с возрастными изменениями: пациентов со слабоумием моложе 60 лет очень мало, а страдающих этим недугом в возрасте 90 лет и старше уже порядка 40–50 процентов. Мы полагаем, что знаем, нарушения работы каких белков участвуют в этой болезни. Чтобы разработать лекарства, нужно знать структуру молекул атомарного разрешения и то, как именно они влияют на клетки в наших телах: являются ли мишенью лекарственных веществ митохондрии, клеточная мембрана или что-то другое, и как происходит их взаимодействие? На эти вопросы, помимо криоэлектронной микроскопии, помогают ответить и другие методы: флуоресцентная микроскопия, рентгеновская кристаллография и ядерно-магнитный резонанс.«Классическая» электронная микроскопия действительно существует уже очень давно. Мы с коллегами начали использовать ее более 10 лет назад, чтобы определить структуру белков, участвующих в преобразовании энергии в клетке. Тогда мы смогли добиться разрешения в 30 ангстрем (10 ангстрем соответствуют 1 нанометру — прим. ред.), — это данные очень низкого разрешения, далекие от атомарного масштаба. Чтобы разрабатывать лекарства, нам необходимо знать строение белка на уровне не менее 2,4 ангстрем, а лучше 1 ангстрем.
Норберт Денчер
руководитель лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессор физической биохимии Технического университета Дармштадта
Найти отличие
Рентгеновская кристаллография — устоявшийся аналитический метод, разрешение которого достигает атомарного и до сих пор превосходит криоэлектронную микроскопию. Около 90 процентов известных на сегодня структур белков изучены именно с помощью рентгеновской кристаллографии. Однако у нее есть свои сложности: перед анализом образцы необходимо кристаллизовать, что чрезвычайно сложно для некоторых белков, например, мембранных.
Комплексы окислительного фосфорилирования митохондрий очень велики и состоят из примерно 50 различных единичных белков. Они имеют большую молекулярную массу, что не позволяет получить кристаллы не только для всего комплекса в целом, но и для некоторых отдельных строительных блоков. В таких случаях криоэлектронная микроскопия и рентгеновская кристаллография дополняют друг друга. Сначала мы можем изучить митохондрию с помощью криоэлектронной микроскопии, а затем разобрать ее на составные части, которые можно кристаллизовать, и проанализировать с помощью рентгеновской дифракции.
Криоэлектронная микроскопия также позволяет делать снимки белков в разных состояниях и конформациях. Это дает информацию о том, как они функционируют. Например, сравнивая конформации, можно изучать светочувствительные белки до поглощения ими фотона и после. Аналогичные исследования можно проводить и с помощью рентгеновской кристаллографии, но только тогда, когда возможно получить кристаллы. Однако примерно в 95 процентах случаев получить их не удается, а для некоторых белков не удастся никогда.
Важно еще и то, что с помощью криоэлектронной микроскопии мы можем видеть биологические компоненты в их естественном состоянии, так как при низкой температуре сохраняется структура.
Криоэлектронная микроскопия также позволяет делать снимки белков в разных состояниях и конформациях. Это дает информацию о том, как они функционируют. Например, сравнивая конформации, можно изучать светочувствительные белки до поглощения ими фотона и после. Аналогичные исследования можно проводить и с помощью рентгеновской кристаллографии, но только тогда, когда возможно получить кристаллы. Однако примерно в 95 процентах случаев получить их не удается, а для некоторых белков не удастся никогда.
Важно еще и то, что с помощью криоэлектронной микроскопии мы можем видеть биологические компоненты в их естественном состоянии, так как при низкой температуре сохраняется структура.
Норберт Денчер
руководитель лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессор физической биохимии Технического университета Дармштадта
Prototype for a Universal Flu Vaccine
Colorized structure of a prototype for a universal flu vaccine. The nanoparticle is a hybrid of a protein scaffold (blue) and eight influenza hemagglutinin proteins on the surface (yellow). The hemagglutinin was specifically engineered to display antibody binding sites common to all human influenza subtypes. The particle designed by Jeffrey Boyington (VRC) has been shown to be an effective immunogen in mice and ferrets (VRC). 3D structure of the particle was determined by cryo-electron microscopy by John Gallagher and Audray Harris (Laboratory of Infectious Diseases).
Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH
Colorized structure of a prototype for a universal flu vaccine. The nanoparticle is a hybrid of a protein scaffold (blue) and eight influenza hemagglutinin proteins on the surface (yellow). The hemagglutinin was specifically engineered to display antibody binding sites common to all human influenza subtypes. The particle designed by Jeffrey Boyington (VRC) has been shown to be an effective immunogen in mice and ferrets (VRC). 3D structure of the particle was determined by cryo-electron microscopy by John Gallagher and Audray Harris (Laboratory of Infectious Diseases).
Credit: National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH
Альтернатива
Ядерный магнитный резонанс — еще один метод, используемый для определения структуры белков и, главное, их динамики.
ЯМР не требует кристаллов, но подготовка высококонцентрированных образцов, которые необходимы для такого исследования, по-своему очень утомительна. Мы использовали этот метод, чтобы выяснить, как один из потенциальных препаратов против болезни Альцгеймера взаимодействует с белком или мембраной. У нашего исследователя ушло полтора года, чтобы подготовить соответствующий образец, а это всего лишь один из вариантов лекарства. Кроме того, этот метод требует очень интенсивных компьютерных вычислений.
Норберт Денчер
руководитель лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессор физической биохимии Технического университета Дармштадта
Что дальше?
Нобелевская премия, врученная за криоэлектронную микроскопию, показывает, насколько серьезно этот метод воспринимается мировым научным сообществом. Два криоэлектронных микроскопа в ближайшее время появится в Исследовательском центре Юлиха в Германии. Если Россия хочет проводить в этой области конкурентоспособные на мировой арене исследования, то ей необходим этот инструмент или, по крайней мере, легкий доступ к нему. Однако сейчас один прибор стоит порядка 8 миллионов долларов. Хотелось бы надеяться, что со временем криоэлектронная микроскопия станет дешевле. Она может открыть новые возможности в исследовании болезней Альцгеймера и Паркинсона. Уже сейчас они оказывают большое влияние на общество, а к 2050 году у нас может быть более 140 миллионов заболевших, если мы не найдем способ вылечить или предотвратить болезнь.
Норберт Денчер
руководитель лаборатории старения и возрастных нейродегенеративных заболеваний МФТИ, профессор физической биохимии Технического университета Дармштадта
В октябре группа ученых, в том числе профессор Дитер Вильбольд — директор института в Исследовательском центре Юлиха и руководитель группы в лаборатории профессора Денчера в МФТИ, — опубликовала статью, где с помощью криоэлектронной микроскопии и магнитно-ядерного резонанса описана структура фибриллы бета-амилоида-1-42. Фибриллы этого пептида участвуют в образовании бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Ученым удалось получить хорошее разрешение структуры, поэтому не исключено, что исследования этой болезни скоро получат новый виток развития.
© 2017
zn@phystech.edu
zn@phystech.edu
